Lựa chọn môi trường nuôi cấy cơ bản cho tế bào động vật

Lựa chọn môi trường nuôi cấy cơ bản

Mỗi môi trường cơ bản được thiết kế đều dựa trên cơ sở kiểu tế bào, nguồn gốc tế bào (loài động vật), và mục đích của nuôi cấy. Thực tế, thành phần môi trường có thể khác nhau rất nhiều phụ thuộc vào yếu tố. Việc cho phép bổ sung các sản phẩm tự nhiên là một giả thiết quan trọng khác cho lựa chọn môi trường cơ bản. Ví dụ, MEM (được phát triển bởi Eagle) thiết kế với giả thiết bổ sung huyết thanh và chỉ bao gồm các thành phần cần thiết tối thiểu (muối vô cơ, đường, amino acid cần thiết, và vitamin tan trong nước). Ngược lại, môi trường M199 và Ham’s F-12, dự định cho nuôi cấy không huyết thanh, chứa nhiều thành phần khác nhau. Liên quan đến lựa chọn môi trường cơ bản, các bạn có thể xem giới thiệu trong y văn và thông tin của nhà cung cấp; ví dụ, các trang về ngân hàng tế bào (ví dụ, www.atcc.org, www.phe-culturecollections.org.uk, cellbank.nibiohn.go.jp, và cell.brc.riken.jp). Một số ví dụ về lựa chọn loại môi trường cho nuôi cấy các kiểu tế bào khác nhau như: α-MEM, DMEM, hay Ham’s F-12 thường được chọn cho nuôi tế bào bám dính; môi trường RPMI 1640 đối với nuôi cấy tế bào dạng huyền phù; và một môi trường hỗn hợp, giống như DMEM/F-12 cho môi trường nuôi cấy không huyết thanh.

Lựa chọn môi trường cơ bản: vai trò của thành phần môi trường

Huyết thanh

Huyết thanh là nguồn cung cấp amino acid, protein, vitamin, carbonhydrate, lipid, hormone, nhân tố phát triển, muối vô cơ, phân tử vi lượng, và các thành phần khác. Nó cũng cải thiện khả năng đệm pH của môi trường và giúp giảm stress (ví dụ, tổn thương vật lý gây ra bởi thao tác pipet và khuấy). Hơn nữa, huyết thanh thay đổi điều kiện bề mặt nuôi cấy, cho phép tế bào bám dính để tăng sinh dễ dàng. Huyết thanh thai bò FBS là phổ biến nhất và được ứng dụng rộng hiện nay. Các loại huyết thanh khác được sử dụng trong một số trường hợp nhất định, bao gồm huyết thanh bê (calf serum CS) và huyết thanh ngựa. Các nhà nghiên cứu có thể chọn loại huyết thanh thích hợp dựa trên cơ sở các đặc tính của nó. Huyết thanh thai bò nhìn chung giàu nhân tố phát triển (Growth factor) và bao gồm mức độ thấp của γ-globulins (chất này có một hoạt động ức chế sự phát triển tế bào). Bởi vậy, nó thích hợp đối với tế bào khó tăng sinh trong nuôi cấy và dùng cho nhân dòng tế bào. Ngược lại, bởi vì huyết thanh bê có một hoạt tính thúc đẩy sinh trưởng yếu, nó đã được sử dụng hiệu quả cho nghiên cứu sự ức chế tiếp xúc lên dòng tế bào 3T3. Nó cũng thích hợp với các nghiên cứu biệt hóa tế bào, trong đó các nhân tố phát triển có thể ảnh hưởng tới kết quả. Mức độ lipid trong huyết thanh tăng lên, với tuổi bê tăng (ví dụ, những ngày say sinh) và bởi vậy huyết thanh bê hay huyết thanh bò trưởng thành đôi khi được chọn, thay vì FBS, khi nuôi cấy tế bào với nhu cầu lipid cao. Huyết thanh ngựa cũng được thu từ ngựa trưởng thành thông qua hệ thống đóng có sự đồng nhất cao giữa các lô. Huyết thanh ngựa có nồng độ thấp của polyamin oxidase, nó tạo polyamines; chất sau có ảnh hưởng tăng sinh tế bào và chuyển hóa kém.

Môi trường nuôi cấy tế bào động vật

Chất thay thế huyết thanh

Khi việc bổ sung huyết thanh là không thích hợp hay không mong muốn, các nhà nghiên cứu có thể chọn một số chất thay thế huyết thanh. Chúng bao gồm chiết xuất huyết thanh, chiết xuất mô hay hydrolysate, nhân tố phát triển, hormone, protein mang như albumin và transferrin, lipids, kim loại, vitamin, polyamine, và các chất khử (bảng bên dưới). Số lượng của sự kết hợp của những chất bổ sung này gần như vô tận và chúng thường tương tác với nhau. Bởi vậy cần có nỗ lực lớn để đưa ra lựa chon, đồng thời mất nhiều thời gian, và tiền bạc: chúng ta không thể thiết kế môi trường tối ưu bởi thử nghiệm chúng đơn giản trong sự kết hợp tùy tiện. Nghiên cứu triệt để trên dữ liệu đã có về sự kết hợp thành công nếu có là rất hữu ích. Sau đây là ví dụ của một quy trình khi các nhà nghiên cứu cố gắng thực hiện nuôi cấy không huyết thanh:

• Thử nghiệm một môi trường trong đó chất bổ sung ITS được thêm vào môi trường DMEM/F-12.
• Nếu sử dụng glutamine, thiết lập nồng độ của nó từ 2-4 mmol/L và xem xét dạng bền: L-alanyl-L-glutamine (xem phần tiếp theo)
• Bổ sung nhân tố phát triển, hormone, vitamin, nguyên tố vi lượng, lipid theo yêu cầu của kiểu tế bào trong nghiên cứu
• Chú ý đến áp suất thẩm thấu
• Khi nuôi cấy tế bào bám dính, xem xét sử dụng các chất, như fibronectin và laminin, cho sự bám dính tế bào
• Đối với nuôi tế bào dạng khuấy, xem xét bổ sung môi trường với tác nhân bảo vệ như Pluronic F-68 để tối thiểu hóa lực cắt
• Làm thích nghi tế bào với môi trường mới với sự thận trọng
• Xác định rằng hiệu quả tế bào không thay đổi trong môi trường mới

Loại	Tên	Đặc điểm	Hạn chế
Huyết thanh, dịch chiết mô	Ví dụ, protein huyết thanh thai bò, dịch chiết tuyến yên	Chứa nhiều thành phần khác nhau, bao gồm protein và lipid của huyết thanh hoặc nguồn gốc từ mô và đóng góp sự sống và tăng sinh tế bào	Thành phần không được xác định và bởi vậy có sự khác nhau rất lớn giữa các mẻ và rủi ro cao với nhiễm; ví dụ bởi virus
Thủy phân (Hydrolysates)	Ví dụ, có nguồn gốc động vật (mô động vật, sữa), nguồn gốc vi sinh vật (nấm), nguồn gốc thực vật (đậu, lúa mạch, gạo)	Hỗ trợ tế bào với vitamin, lipids, các muối vô cơ, peptides trọng lượng phân tử thấp, và amino acid. Hiệu quả được xác nhận đối với nuôi cấy trứng chuột vàng Trung Quốc, tế bào lai Hybridoma, thận chuột hamster non, Vero, và tế bào Lymph. Tinh sạch kháng thể và protein tái tổ hợp được làm đơn giản bởi vì thành phần nghi ngờ chứa trong đó chỉ là các chất có trọng lượng phân tử thấp, từ siêu lọc.Rẻ hơn nhiều so với huyết thanh.	Thành phần không được xác đinh; bởi vậy, có một sự khác nhau lớn giữa các mẻ. Có nguy cơ nhiễm cao, ví dụ, bởi virus khi có nguồn gốc từ động vật. Rủi ro vẫn không phải là không có thậm chí các sản phẩm có nguồn gốc thực vật: ví dụ, khi tiếp xúc với động vật hoặc sản phẩm nguồn động vật trong quá trình nuôi trồng hoặc sản xuất. Sự cảnh báo là cần thiết bởi vì nguyên liệu thô có thể bị tiếp xúc với nồng độ cao của thuốc trừ sâu hoặc diệt cỏ.
Nhân tố phát triển – Growth factors	Ví dụ, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF	Hoạt động với lượng nhỏ trên tế bào; ví dụ, để kích thích tăng sinh, biệt hóa, di chuyển, chế tiết, hoặc nhập vào. Nhiều tế bào yêu cầu sự bổ sung môi trường với nhân tố phát triển dưới điều kiện không có huyết thanh. FGF dễ bị phân hủy nếu heparin sulfate không có trên bề mặt tế bào đích; bởi vậy, heparin (hoặc dextran tổng hợp như là một chất thay thế) được thêm vào môi trường trong một số trường hợp	Các nhân tố phát triển có nguồn gốc động vật đặt ra một rủi ro về nhiễm; ví dụ, bởi virus. Việc sử dụng protein tái tổ hợp giảm rủi ro nhiễm; tuy nhiên, rủi ro không hoàn toàn là không có bởi vì protein có thể được sản xuất bằng các enzyme thu nhận từ động vật trong quy trình sản xuất và một số lý do khác. Được giải phóng bởi tiểu cầu, TGF-β hoạt động như một chất ức chế sinh trưởng trên nhiều tế bào biểu bì.
Hormones	Ví dụ, hormone sinh trưởng, insulin, hydrocortisone, estrogen, androgens, progesterone, prolactin, hormone kích thích nang trứng FSH, gastrin-releasing peptide	Hormone tăng trưởng và insulin đẩy mạnh sự tăng sinh của nhiều loại tế bào khác nhau. Hydrocortisone cải thiện hiệu quả tạo dòng của tế bào thần kinh đệm và nguyên bào sợi và cần thiết cho việc duy trì tế bào biểu bì và một số loại tế bào biểu mô. Triiodothyronine là cần thiết cho tế bào biểu mô MDCK và được sử dụng cho biểu mô phổi. Cùng với hydrocortisone và prolactin, sự kết hợp khác nhau của estrogen, androgens, và progesterone là cần thiết cho duy trì biểu mô động vật có vú	Insuline là không ổn định ở 37 độ c (đặc biệt trong sự có mặt với nồng độ cao của cysteine) và bởi vậy phải được thêm vào môi trường ở nồng độ tương đối cao. Hơn nữa, kẽm là cần thiết cho insulin sử dụng hoạt tính sinh học của nó và các nhà nghiên cứu nên sử dụng bổ sung kẽm vào môi trường. Hydrocortisone mà có mặt trong huyết thanh thai bò hoạt động như một chất ức chế phát triển với mật độ nuôi cấy cao (nhiều tế bào được đóng gói chặt chẽ; ví dụ, tế bào thần kinh đệm, tế bào biểu mô phổi). Ngược lại, đôi khi nó thúc đẩy sự phát triển ở nuôi cấy mật độ thấp.
(Protein vận chuyển) Carrier proteins	Albumin, transferrin, lactoferrin, và các protein khác	Albumin được sử dụng như một chất vận chuyển của nhiều loại chất khác nhau, bao gồm lipids (ví dụ acid béo, cholesterol), các phân tử dạng vết (ví dụ, đồng, nickel), amnio acid (cysteine, tryptophan), và vitamins (pyridoxal phosphate: dạng hoạt động của vitamin B6). Vì lipids không tan trong nước, chúng được cung cấp hiệu quả hơn với tế bào sau sự hình thành phức hệ với albumin. Hơn nữa, albumin trung hòa độc tính, kháng ô xi hóa, và giảm ảnh hưởng stress. Transferrin được sử dụng như một chất vận chuyển của sắt. Lactoferrin có thể phục vụ như chất thay thế transferrin.	Nếu những tác nhân này nhận từ huyết thanh, vẫn có rủi ro của nhiễm; ví dụ, bởi virus. Hầu hết albumin không có nguồn gốc từ huyết thanh được phân phối hiện nay được tinh sạch từ Ngô bằng cách sử dụng phương pháp tách ethanol lạnh. Sản phẩm chuẩn bị theo phương pháp này có tỷ lệ thấp hơn của cac protein khác. Hơn nữa, mức độ lipids và các phân tử dạng vết được gắn với albumin khác nhau theo mẻ. Đôi khi, sự khác biệt giữa các mẻ được qua sát như một kết quả: các nhà nghiên cứu nên thực hiện kiểm tra các mẻ trước sử dụng những sản phẩm này. Transferrin nhận từ huyết thanh bao gồm các hợp chất có nguồn gốc người, bò và lợn. Vì transferrin bò có hoạt động thấp điển hình, các nhà nghiên cứu trong một số trường hợp làm việc quanh vấn đề này; ví dụ, bởi nâng cao nồng độ.
Lipid và các thành phần liên quan	Cholesterol, steroids, acid béo (ví dụ, palminate, stearate, oleate, linoleate), ethanolamine, choline, inositol, và các chất khác	Phục vụ các vai trò khác nhau: như các thành phần màng, về lưu trữ dinh dưỡng và vận chuyển, trong truyền tín hiệu. Nhiều dòng tế bào được thiết lập có thể sinh tổng hợp lipid mà cần thiết cho trao đổi chất từ acetyl coenzyme A, nhưng bổ sung lipid vào môi trường giảm bớt áp lực sinh tổng hợp. Hơn nữa, một số tế bào thiếu enzyme cần thiết cho con đường tổng hợp cholesterol: một nguồn của sterols phải được bổ sung vào môi trường để nuôi cấy các tế bào này. Việc sử dụng lipoprotein và albumin là gần nhất về mặt sinh lý và cách hiệu quả nhất để hòa tan protein và đưa chúng tới tế bào	Khi xây dựng một môi trường nuôi cấy dưới điều kiện không protein, các nhà nghiên cứu phải sử dụng ethanol, chất hoạt động bề mặt (ví dụ, Pluronic F-68, Tween 80), hoặc cyclodextrin để hòa tan lipids. Nếu cồn được sử dụng cho sự hòa tan, người ta phải thêm một lượng ≤1 mL/L (v/v) theo quan điểm của những ảnh hưởng không tốt lên tế bào. Sự cảnh báo được khuyên khi sử dụng các chất bề mặt và cyclodextrin: chúng độc với tế bào ở nồng độ cao, dẫn đến sự hòa tan lipid kém ở nồng độ thấp, và có thể bị loại bỏ bởi lọc. Nhiều thành phân lipid có trên thị trường có nguồn gốc từ động vật và hiệu quả của chúng khác nhau
Kim loại chuyển tiếp Transition metals	Ví dụ, Fe, Zn, Cu, Cr, I, Co, Se, Mn, Mo	Đây là các thành phần chuyển tiếp vì chúng dễ dàng chuyển electron, bởi vậy chúng có chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme và chất hoạt động sinh lý bên trong tế bào. Se, Fe, Cu và Zn, đặc biệt, được sử dụng chung cho nuôi cấy tế bào. Se có một hoạt tính kháng oxi hóa theo dạng selenoprotein, như glutathione peroxidase và thiordoxin reductase	Các tác nhân bắt giữ có thể cung cấp như chất thay thế đối với chất màng Fe, chuyển, trong trường hợp ở đó nó phải được loại bỏ khỏi môi trường. Sự cảnh báo vẫn cần thiết: Phụ thuộc vào các loài, mật độ của tác nhân chelate hóa, không chỉ nó có thể không hiệu quả như chất mang, nó phải thúc đẩy sản xuất các gốc ô xi hóa tự do
Vitamins	Vitamin tan trong chất béo (A, D, E, K), vitamin tan trong nước (ví dụ B1, B2, B6, B12, C, folate)	Cần thiết cho sự sinh trưởng và phân chia tế bào như là tiền chất cho nhiều loại cofactor. Vitamin C và E có hiệu quả kháng oxi hóa khác. Vitamins có mặt trong hầu hết môi trường cơ bản, nhưng kiểu của chúng và số lượng (đặc biệt loại vitamin tan trong chất béo) là hạn chế ở một số trường hợp; bởi vậy, chúng được bổ sung theo yêu cầu của loại tế bào	Vitamin A, C, D và E dễ bị phân hủy bởi quá trình ô xi hóa trong không khí. Tuy nhiên, vitamin C, hoạt động với các nguyên tố vi lượng và phân hủy ô xi hóa, đôi khi tạo các gốc ô xi hóa. Vitamin A, B1, B2, B12, C và K dễ dàng bị phân hủy bởi ánh sáng; vitamin B1 và B5 dễ dàng phân hủy bởi nhiệt. Folate có khả năng tan kém và bị loại bỏ một phần trong quá trình tiệt trùng bằng lọc trong một số trường hợp. Tương tác Hydroxocobalamin và và vitamin C, thúc đẩy phân hủy lẫn nhau
Polyamines	Putrescine, spermidine, spermine	Các amin hoạt động sinh lý, trọng lượng phân tử thấp mà tồn tại khắp trong tế bào và thức đẩy tổng hợp protein hoặc acid nucleic. Nồng độ nội bào của polyamine được điều hòa và duy trì cả bởi tổng hợp hoặc sự phân hủy bên trong tế bào bởi vận chuyển từ ngoài tế bào	Sự phát triển tế bào dừng lại nếu nồng độ polyamin nội bào thấp quá do sự cân bằng bị phá vỡ giữa sinh tổng hợp lokyamine và phân giải, vận chuyển. Hơn nữa, chết theo chương tình được kích ứng nếu nồng độ polyamine nâng quá cao.
Chất khử	2-mercaptoethanol, α-thioglycerol, reduced glutathione	Nhập cystine hoặc cysteine là cần thiết để duy trì môi trường oxi hóa nội bào và thêm các tác nhân giảm vào môi trường nuôi cấy các tế bào mà thiếu các chất vận chuyển cysteine, sau đó những tế bào này có thể nhập cystine hay cysteine	Sự cản báo là cần thiết khi bổ sung các chất giảm trong sự vắng mặt của albumin: phương pháp tiếp cận này gây tổn thương tế bào.
Chất bảo quản, chất tẩy	Carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, Pluronic F-68, Tween 80, và các chất khác	Giảm stress được hình thành trong nuôi cấy khuấy và bởi thao tác pipet. Pluronic F-68 và Tween 80 cũng được sử dụng như chất làm tan của các chất phospho lipid (ví dụ, lipid, các vitamin tan trong dầu)	Chất hoạt động bề mặt đôi khi cho thấy độc với tế bào phụ thuộc vào nồng độ của chúng
Các yếu tố bám dính	Ví dụ, fibronectin, laminin	Thúc đẩy sự gắn kết của tế bào phụ thuộc vào sự gắn với chai nuôi cấy	Cho thấy rủi ro của nhiễm virus nếu các thành phần có nguồn gốc sinh học được sử dụng

Môi trường không huyết thanh và protein mà được bán bởi nhiều nhà sản xuất hầu như cho thấy hiệu quả tốt và các nhà nghiên cứu có thể sử dụng chúng để nuôi cấy tế bào của họ quan tâm. Tuy nhiên, thành phần của chúng hầu như chưa bao giờ được tiết lộ vì lý do thương mại, và bởi vậy, về mặt kỹ thuật, những môi trường này không thể gọi là môi trường xác định về thành phần hóa học.

Tham khảo

http://www.kythuatysinh.net/lua-chon-moi-truong-nuoi-cay-co-ban/